工藝和質粒設計優化、一次性設備和靈活的平臺工藝都發揮著重要作用。
隨著大量信使 RNA (mRNA) 疫苗和基于病毒載體的療法通過臨床試驗取得批準和商業化，對質粒的需求正在急劇上升。上游生產工藝是將質粒 DNA (pDNA) 材料推向市場的重要組成部分，因為在大規模條件下實現最高產量對于滿足未來需求至關重要。預計發酵將成為大規模生產高質量 pDNA 產品的主要方法。
上游質粒生產：發酵、收獲和裂解
對于通過發酵生產的傳統生物制品，上游操作與發酵和收獲有關。然而，根據 Catalent Cell & Gene Therapy 的 pDNA 工藝和分析開發負責人 Nuria Gomez Santos 的說法，對于質粒生物生產，將細胞裂解和澄清作為上游工藝的一部分也很常見。 “根據這些工藝單元操作中細菌細胞或細胞碎片的存在（上游）和不存在（下游）來確定截止點，”她解釋說。 Catalent 使用 0.2 μm過濾步驟應用這種截斷，以進一步分離上游和下游操作。
AGC Biologics 的 pDNA 和 mRNA 首席工藝開發經理 Karl Varadi 說，一些公司將收獲的生物質的重懸、隨后的堿裂解、澄清和濃縮/洗濾視為中游工藝 (MSP)，包括捕獲、精純和其它相關純化、配制和灌裝/完成步驟是下游工藝的一部分。鑒于裂解、中和和澄清在 pDNA 生產中的重要性，突破性藥物中心核酸和質粒操作高級主管 John Bowen 同意這些步驟應該作為中游單元操作單獨考慮。
R&D、GMP-like 和 GMP 質粒不影響上游操作
對藥品生產商采取基于風險的生產方法的期望引起了人們對藥品生產中使用的關鍵材料所采用的生產實踐的關注，即使它們不會出現在最終藥品中。此類輔助材料包括用作模板的質粒 DNA，用于生產 mRNA 和用作遞送基因載荷的病毒載體。總的來說，該行業正朝著使用最高質量的材料進行臨床和商業化生產的方向發展，不僅是關鍵原材料，還有輔助材料。大多數 pDNA 生產商因此提供三種不同的產品等級以供不同階段使用：R&D、GMP-like和cGMP。
“不同的質量等級針對不同的應用，”PlasmidFactory 首席執行官 Martin Schleef 表示。 “對于新型治療基因候選產品或基因遞送策略的最初測試，R&D級質粒就足夠了。研究過程的進一步完善導致臨床和商業應用的GMP-like中間級和最高 GMP 等級，”他觀察到。
用于 mRNA 和病毒載體生產的質粒可以是中間級或 GMP 級，這取決于藥物生產商的偏好。 PlasmidFactory 的項目經理 Marco Schmeer 表示，用于直接臨床應用的質粒，例如 DNA 疫苗，必須是 GMP 級的。
“更高質量的等級，”Schleef 說，“通常是在專門的生產空間生產的，作為主動質量管理系統的一部分進行更廣泛的質量控制檢測，并有更多的文件包。”
然而，根據 Santos 的說法，質量等級對上游和下游工藝操作沒有重大影響，因為執行相同的平臺工藝來生成R&D、GMP-like和 GMP 級質粒。事實上，如果上游工藝從一開始就考慮到生產因素，那么就不會對工藝開發產生影響，Varadi 對此表示贊同。 “理想情況下，定義明確的上游工藝是通過縮小現有 GMP 生產基礎設施的規模來啟動和設計的，以彌補技術差異。這種方法允許生成一個強大且易于放大的工藝，然后只需要通過GMP-like/GMP 的文檔來完成，”他評論道。
例如，在Catalent，R&D級材料是使用規模縮小模型生成的，該模型的運行參數設置點與其潔凈室中的相同，Santos 指出。這種具有代表性的研發材料已用于工藝開發目的和臨床前研究。 GMP-like 和 GMP級 質粒均使用完全可追溯的原材料和完全一次性的合格設備生產。操作是相同的，只是共享文檔和質量監督級別在這些等級之間有所不同。
從工藝優化到菌株工程
治療和疫苗應用所需的 pDNA 數量不斷增加，質粒設計和發酵策略成為人們關注的焦點。 Varadi 認為，為了幫助針對預期的巨大市場需求做好準備，治療藥物和疫苗應用所需的 pDNA 數量不斷增加，質粒設計和發酵策略成為人們關注的焦點。
質粒通常通過高生物量補料分批發酵工藝、以大腸桿菌（E.Coli）菌株中重組產生。 Catalent Cell & Gene Therapy 產品開發高級經理 Matthias Craig 表示，通過解除對質粒復制的抑制，可以通過多種方式實現高滴度。在過去的二十年里，高產質粒發酵工藝得到了極大的發展和優化，”他說。
Varadi 表示同意，補料分批方案的實施提高了 pDNA 產量，提高了批次成功率并優化了成本效率。他補充說，了解調節質粒拷貝數的分子機制并在下一代質粒骨架中實施它們，將有助于進一步提高含有挑戰性基因載荷的質粒的產量。
“發酵確實變得更加復雜，以實現質粒生產的預期目標，例如單位生物量的質粒產量，”Schleef 觀察到。不過，他警告說，維持質粒結構穩定性等更復雜的問題仍有待解決。
Bowen 評論說，上游 pDNA 工藝開發的一些最大因素包括培養基優化、補料分批策略和E. coli 菌株選擇。根據 Craig 的說法，改進E.Coli宿主菌株的工程工作在某種程度上最近比發酵工藝優化更受關注。 “這些菌株的特點是發酵滴度更高和/或導致易于發生缺失/重組事件的核酸序列穩定性增加，例如反向末端重復序列 (ITR) 和長 polyA 尾，”他解釋道。
Craig 指出的另一項重要進展是批次和連續細胞裂解方法的開發，這些方法可提供高回收率并適應更高的生產規模。同時，在上游操作中采用一次性設備顯著降低了交叉污染的可能性，這在生產大量質粒的多產品設施中非常重要，Bowen 觀察到。
上游工藝挑戰
在執行 pDNA 生產的上游工藝時，生產商必須克服許多挑戰。 PlasmidFactory 的研發經理 Ram Shankar 說，首先也是最重要的是，pDNA 可以實現非常高的單位體積產量，但這樣的產量遠低于過表達的無毒重組蛋白的產量。
“話雖這么說，但如果不能保證質粒的穩定性和同質性，那么簡單地使每個細胞過量生產質粒不會走得太遠。在設計質粒生產的上游工藝時，必須考慮這些方面，”Shankar 指出。 “在這種情況下，”他繼續說道，“我們制定了一些策略，可以在不依賴抗生素的情況下保持高生產率，同時控制產品中關鍵序列結構的維護（例如，生產性腺相關病毒的 ITR 序列 [AAV]生產或用于 mRNA 生產的 polyA 尾）。
根據 Varadi 的說法，另一個常見問題是實現質粒的高產量生產，這些質粒包含挑戰性基因有效載荷（目的基因大小、堿基組成、毒性、選擇標記的使用）。同時，對宿主細胞施加顯著代謝壓力的較大質粒會降低培養適應性，導致生長不良和質粒拷貝數降低。不過，他補充說，嚴格控制碳源和氮源的供給以及使用替代的非抗生素選擇標記可以減少宿主細胞的代謝負擔。
Craig 強調，建議科學家和藥物開發人員驗證他們的質粒構建體具有非常高的拷貝數性質。 “這一特性與質粒復制起點中單點突變的存在有關，并進一步抑制質粒復制，可使質粒滴度增加達5倍，”他解釋道。
Varadi 評論說，導致生長期蛋白過早表達的泄漏啟動子也可能不利于上游質粒的成功。他補充說，一些大的 pDNA 損失也可能發生在堿裂解過程中。事實上，明確定義的堿裂解步驟在減少質粒損失方面遠比避免下游層析操作期間的循環性能重要得多，他認為。“裂解步驟有幾個需要很好平衡的關鍵參數，如緩沖液體積、緩沖液接觸時間，以及混合過程中施加的剪切力，”Varadi 解釋道。
質粒上游工藝的效率和生產力
質粒 DNA 發酵和細胞裂解是復雜的過程，會受到許多不同工藝參數的影響。據Santos說，質粒滴度和質量，包括超螺旋質粒含量，都會受到直接影響。 “適當控制質粒復制抑制和誘導是達到高單位體積和特異性產量的關鍵。在發酵過程中，這是通過使用適當的培養基、對細菌生長速率的有力控制、適當的溫度設定點和氧氣的可用性來實現的，”她說。對于細胞裂解，Santos 強調，在不降解產品的情況下，盡可能多地從E.Coli生物質中回收材料至關重要。 “精細且平衡良好的堿裂解方法是實現這一目標的首選單元操作，”她觀察到。
可以采取幾個步驟來提高 pDNA 發酵和裂解過程的效率和生產力。根據 Varadi 的說法，在細胞系開發過程中，降低細胞應激通常會提高所產生的 pDNA 的質量和數量。在發酵過程中，減少代謝負擔和使用精心設計的補料分批方案非常有益，因為降低代謝負擔可以提高產品產量。
Shankar 表示，在批次操作期間更密切地實時監測關鍵參數，例如在線細胞密度測量和多次生產運行的比較，都在改進質粒發酵過程中發揮著重要作用。 “針對各種關鍵工藝（排氣）參數實施工藝分析技術工具，結合產品參數（質粒含量和同質性）的近線分析，有助于揭示工藝變量的隱藏影響，”他說。
Varadi 希望看到的一件事是設備供應商推出其設備的規模縮小版本（例如，實驗室規模）。 “在優化規模縮小的工藝中進行工藝開發可以使上游工藝在放大時更加可靠和穩健，”他爭辯道。
轉向平臺化質粒發酵工藝
重組蛋白和單克隆抗體平臺生產工藝的成功開發產生了針對其它生物材料（包括 pDNA）建立類似平臺解決方案的愿望。
“我們的目標是找到一個適合所有產品的工藝，而不是針對不同的質粒優化每個工藝。這將提供成本和時間優勢，最終加速向患者提供治療，”Craig評論道。 “運營一個強大的質粒生產平臺，促進項目從 IND 前 [研究性新藥申請] 階段向臨床和市場的過渡，可以交付具有預期純度的所需產品數量，從而大大加快開發時間表，”他補充道。
然而，這并不容易做到。 “平臺工藝的開發在一定程度上是可能的，但不可能對于每種類型的質粒都有靈丹妙藥，”Schmeer 說。 “單個質粒的大小和序列會對上游工藝效率產生巨大影響，而這往往沒有得到充分認識，”他補充道。
Santos 表示同意，平臺工藝的輸出可變性主要與質粒序列本身的特異性有關。 “大型構建體的產量往往較低，攜帶重復序列（如 ITR 和 polyA 尾）的質粒已被證明更容易發生缺失和重組事件，”她指出。
根據 Bowen 的說法，解決方案是通過在工藝開發過程中研究各種質粒類型（大小、復雜性等）和E.Coli菌株來開發一個“靈活”的平臺，以確定它們對質粒產量和質量的影響。這將在生產后續質粒時提供靈活性。
Craig表示同意，為穩健的平臺工藝增加優化靈活性有助于質粒數量的交付，包括滿足具有挑戰性的質粒的質量規范。他還指出，使用現成的質粒可以進一步加快時間表。 “預先擁有一組特征良好的質粒，例如 pHelper 和 pREPCAP 質粒，將為后續應用節省寶貴的時間，特別是在與平臺工藝結合使用時，”他說。
對于 Varadi 而言，開發用于上游質粒生產的平臺工藝不僅是可能的，而且是強制性的。 “一個精心設計的平臺包含多種質粒類型，并擴大了潛在客戶的范圍，同時降低了生產成本，”他評論道。 Varadi 補充說，成功的關鍵之一是通過減少主鏈和目的基因盒內的“垃圾”DNA 延伸來優化質粒的大小。他還指出，宿主細胞和質粒主干突變的組合（已在文獻中進行了表征）有利于拷貝數增加，應針對工業目的進行評估。
解決未來的上游需求
毫無疑問，未來幾年對質粒 DNA 的需求將繼續增加。 Varadi 爭辯說，所有需要 pDNA 作為原材料的治療類型都在大規模擴展，并且需要生產它們的“后臺”行業。
“在接下來的幾年里，高產能生產將不會是 pDNA 生產商的唯一先決條件；他們還需要有能力以更小的數量生產多種不同的結構，”Varadi 觀察到。 “滿足需求需要高產能生產，但這不能僅通過上游工藝優化來實現。廣泛實施一次性技術和簡化的可放大性解決方案作為從非 GMP 工藝開發實驗室到 GMP 車間的鏈接將是必要的，”他堅持說。
Shankar 表示，規模和質量確實是未來 pDNA 生產必須解決的兩個關鍵方面。他同意“通過采用一次性技術實施上游工藝的 GMP 質粒生產將扭轉新型先進治療藥物產品的生產潮流。”
