在創新藥等生物制藥的過程中，建立菌種庫的意義在于利用菌種庫系統進行充分的質量檢測并以此最大程度的控制和減少污染和菌種的性質改變。科研人員為了達到菌種庫建立的目的，在建立菌種庫時需要菌種庫具備足夠數量的菌種和維持菌種的均質性，用以確保研發和生產過程中所用的菌種的來源的一致性。
關鍵詞
三級種子庫
菌種庫的構建
什么是三級菌種庫？
菌種建庫建立的三級種子庫包括
1. 原始種子庫(pre-master cell bank/research cell bank, PCB/RCB）
2. 主代種子庫(master cell bank,MCB)：從原始種子批傳代、擴增后保存的為主種子庫
3. 工作種子庫(working cell bank,WCB)：從主種子庫進行批傳代、擴增后保存即為工作種子庫
每批種子庫都應按規程的要求進行保管、檢定和使用。為了保障生物制品的安全性，必須對其進行嚴格的檢測，確定其達到相關技術標準要求。
三級菌種庫不僅僅是簡單的將菌種按照傳代或者特性分為三個級別，而是對于菌種的保存與運用設置了三種基礎的質量和程序要求，以確保菌種在長期的、大規模的生產應用中的穩定性和可溯源性等。
主菌種庫與工作菌種庫的區別
主菌種庫是從PCB分離出來的單菌落，然后對該單菌落經過傳代，增殖后混成均質菌懸液，定量分裝于凍存管，并采取適當方法保存的用于制備工作菌種庫的菌種來源。
工作菌種庫是由主菌種庫再傳代增殖后，混成均質菌懸液，定量分裝于凍存管，并采取適當方法保存的用于商業化生產的菌種來源。發酵所用的菌種除了常規的檢測指標，如菌落形態外觀、生產能力和其他生化指標外，還需要檢測：如污染菌檢査（微生物、真菌、支原體的檢測分析）、組分檢測、孢子量檢測等才能被作為工作菌種庫保存和使用。
在實際運用過程中，部分企業將主菌種庫和工作菌種庫簡單的以傳代次數和保存條件進行劃分。
這種區分方法是絕對錯誤的，在短期生產或無后續研究的情況下或許不會出現缺漏，但只要進入長期、大規模生產階段，這種區分方法就帶來工作菌種的質量和性質不穩定等諸多問題。出現以上問題的主要原因是沒有理解主菌種庫與工作菌種庫之間的關系。
1、來源的不同，MCB來源于初始菌株的單菌落，如誘變后的高產菌種，在經過穩定性驗證后，從這一高產單菌落中進行增殖獲得的一系列的菌懸液。WCB是從MCB擴增而來，但并不出自于MCB的單菌落。
2、對法規理解偏差，如果每年的使用量特別小，當MCB足以支持生產需要時，便沒有必要設置WCB。
3、MCB和WCB在工藝和質量放行的標準上存在不同。一般MCB比WCB在使用和標準上更嚴格。
什么樣的菌種才可以作為工作菌種？
微生物發酵產品通常會采用化學、物理誘變方法或者基因技術對微生物菌種進行選育或基因改造，得到一個更高產能效率的新菌種。得到的高產菌株，如果經過生產能力，傳代穩定性，組分檢測、孢子量等檢測指標，尤其是雜質指紋比較后，確定沒有問題后就可以建立新的主菌種庫，而用于商業化生產。
菌種庫的構建
菌種庫構建過程主要需要注意以下幾個方面
1. 建庫用菌種的溯源性
2. 菌種建庫過程合規性
3. 建庫菌種的檢定要求
4. 菌種傳代穩定性研究
一、溯源性
為保證菌種的可溯源性菌種庫構建資料要求具備基因、載體和宿主細胞的來源及改造過程。其來源明確清晰，切實可靠，其演化歷史也必須清楚。
目的基因：
為確保目的基因的可溯源性菌種庫必須確定其來源、設計和改造過程，并且要求來源明確清晰，歷史演化過程清楚。
表達載體：
為保證表達載體的可溯源性菌種庫構建資料要求具備表達載體的來源、名稱、結構等信息，說明重組質粒的構建和檢定過程。載體來源應當清楚，明確其出處以及可靠性。
宿主細胞：
宿主細胞的來源要明確，提供其名稱、生物學特性，檢定結果等信息。
二、菌種建庫過程合規性
建庫流程：依照法規規定，從篩選到的高表達菌株單克隆經反復純化擴增驗證后，凍存于-80℃，即為原始種子庫。取一只原始種子，復蘇后擴增驗證，然后混合一定濃度的甘油后在-80℃凍存，即為主種子庫。取主種子進行復蘇后擴增驗證，然后混合一定濃度的甘油后在-80℃凍存，即為工作種子庫。所有的種子都要嚴格記好株名、批號、編號、凍存日期、分裝數量、放置位置及取用記錄等。
①需在GMP體系完成建庫工作，建庫流程、儲存、運輸過程都要形成SOP管理文件。
②保證均質性，如果是使用了多個容器培養，分裝前需要有合適的方法充分混勻。
③為保證工作種子庫、主種子庫與原始種子庫的生物學特性一致，建庫過程中不得有單克隆挑選和菌種篩選的行為。
星耀小TIP：
GMP標準（藥品生產質量管理規范）是為保證藥品在規定的質量下持續生產的體系。它是為把藥品生產過程中的不合格的危險降低到最小而訂立的。GMP包含方方面面的要求，從廠房到地面、設備、人員和培訓、衛生、空氣和水的純化、生產和文件。
三、建庫菌種的檢定要求
①菌落形態及抗生素抗性，考察菌種在含與不含抗生素培養基上生長的菌落形態及抗生素抗性。
②生化反應，考察工程菌是否具有典型的大腸桿菌生化反應。
③染色鏡檢，考察工程菌菌體形態及革蘭氏類別。
④重組表達載體酶切檢定，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質粒酶切后DNA片段大小符合理論值。
⑤基因序列測序，驗證重組表達載體上的目的基因序列的正確性。
⑥電鏡觀察，通過電鏡觀察菌體形態，支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染情況。
⑦菌體目的蛋白表達檢定，通過SDS-PAGE檢測分析重組質粒是否表達目的蛋白。
⑧菌體表達蛋白免疫原性檢查，通過Western-blot檢測分析重組質粒表達的重組蛋白是否具有正確的免疫原性。
《中國藥典》三部中規定了細胞基質的質量要求，包括：細胞鑒別（種屬、株及專屬特性）；外源因子污染檢查（包括病毒性及非病毒性內外源因子）；成瘤性及致瘤性檢測；染色體核型；均一性及穩定性等。
四、菌種傳代穩定性研究
根據《中華人民共和國藥典》相關要求，種子庫要開展傳代穩定性研究，明確限傳代次數，使用壽命，評估是否能夠滿足未來商業化生產需求。在開展傳代穩定性研究時應在模擬實際的生產條件下開展。通常對重組質粒穩定性和表達穩定性研究的方法為：對種子庫菌種多代次培養，通過雙酶切檢測與菌體PCR檢測，確定傳代50次后質粒是否丟失。通過對傳代50代的菌液誘導培養后，對菌體表達的目的蛋白量進行SDS-PAGE檢測，確定傳代后的表達穩定性。
總結
綜上所述，三級菌種庫的建立不僅僅是為了為菌種的保存和追溯提供切實的依據，而且是在GMP審查以及IND申報時所必需的數據來源。因此在建立三級菌種庫之時所需要考慮的不僅包括菌種庫本身的基本要求，而且要把IND申報的要求考慮在內。在保證符合國家關于菌種庫建立的要求之外，符合IND申報和GMP體系的要求。
