使用一次性系統(tǒng)連續(xù)生產(chǎn) mAb 可以在更短的時(shí)間內(nèi)用更小的設(shè)備生產(chǎn)更多的 mAb，更準(zhǔn)確地說(shuō)，體積減少了 5-10 倍。這是通過(guò)提高生產(chǎn)力和減少非增值操作（例如保持步驟）來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這同時(shí)降低了資本和運(yùn)營(yíng)費(fèi)用。這與對(duì)過(guò)程控制和設(shè)備的更高要求、高培養(yǎng)基消耗和通常低產(chǎn)品滴度形成鮮明對(duì)比。使用一次性系統(tǒng)的這種方法相關(guān)的典型特異性生產(chǎn)率約為 1 g/L/day，產(chǎn)品滴度在 0.3 和 1 g/L 之間。然而，最近，WuXi Biologics 使用其實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的連續(xù) USP 平臺(tái)生產(chǎn)融合蛋白，報(bào)告了 2.5 g/L/day 的前所未有的生產(chǎn)力。
幾年來(lái)，人們對(duì)連續(xù)工藝越來(lái)越感興趣，尤其是對(duì)于 mAb 生產(chǎn)，這也是由于連續(xù)操作對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)品供應(yīng)的積極影響。因此，有可能：(1) 在穩(wěn)態(tài)條件下操作時(shí)獲得一致的產(chǎn)品質(zhì)量（這在補(bǔ)料分批模式下可能會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，具體取決于培養(yǎng)時(shí)間），(2) 降低人為錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)，以及 (3)快速響應(yīng)不斷變化的供應(yīng)需求。此外，通過(guò)始終如一的高細(xì)胞活性，產(chǎn)品中的雜質(zhì)（例如 HCP 和細(xì)胞碎片）水平保持在較低水平。
2015 年，Godawat 等人描述了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的第一個(gè)完全連續(xù)的 mAb 生產(chǎn)，工作體積為 12 L。該工藝運(yùn)行了 31 天，通過(guò) ATF、Protein A層析、病毒滅活、陽(yáng)離子交換層析和最終膜過(guò)濾進(jìn)行全自動(dòng)產(chǎn)品純化。2019 年，Arnold等人報(bào)告了首次完全連續(xù)中試規(guī)模 mAb 生產(chǎn) (50 L) 的結(jié)果。作者計(jì)算出，通過(guò)將補(bǔ)料分批設(shè)施（4 × 12.5 m3生物反應(yīng)器）替換為連續(xù)式設(shè)施（5 × 2 m3 連續(xù)運(yùn)行的一次性生物反應(yīng)器和純化系統(tǒng)），可以節(jié)省 15% 的成本。同年，荷蘭-澳大利亞公司 Biosana 獲得了一種治療性生物仿制藥 mAb (Omalizumab) 的 1 期臨床試驗(yàn)批準(zhǔn)，該試驗(yàn)采用完全連續(xù)的生產(chǎn)方法（工作體積為 50 L 的生物反應(yīng)器），并于 2020 年 3 月取得了可喜的結(jié)果。但是，正如前文中提到的那樣，在完全連續(xù)的設(shè)施中生產(chǎn)的商業(yè) mAb 仍處于臨床開發(fā)階段。
連續(xù)一次性上游工藝
相反，實(shí)施連續(xù) USP 的混合工藝方法自 1994 年以來(lái)一直用于生產(chǎn)商業(yè)生物治療產(chǎn)品（即使它們沒(méi)有被宣布為連續(xù)的一次性 USP）。行業(yè)還報(bào)道了其目前被用于生產(chǎn)越來(lái)越穩(wěn)定的分子的趨勢(shì)。這種連續(xù)灌流工藝（其中營(yíng)養(yǎng)耗竭的培養(yǎng)基和產(chǎn)品連續(xù)排出）的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)一種穩(wěn)定狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量可以長(zhǎng)時(shí)間保持且偏差最小化。
為了在 30 到 90 天的工藝操作期間保持必要的恒定 VCD 和高細(xì)胞活性，必須根據(jù)生長(zhǎng)速率調(diào)整細(xì)胞廢棄率。在穩(wěn)定條件下連續(xù) USP 運(yùn)行的時(shí)間越長(zhǎng)，生物反應(yīng)器的時(shí)-空產(chǎn)率就越高。連續(xù) USP 的關(guān)鍵組成部分是一次性生物反應(yīng)器，包括其傳感器和自動(dòng)化技術(shù)，以及前文中介紹的細(xì)胞截留裝置，特別是 ATF 設(shè)備，其已被證明可以支持這樣的連續(xù)上游工藝，其中，目標(biāo)特異性生產(chǎn)率超過(guò) 1 g/L/day。且中試和工業(yè)規(guī)模工藝傾向于使用一次性 ATF 系統(tǒng)。
下圖顯示了使用連續(xù) USP 的現(xiàn)代mAb 生產(chǎn)流程的典型代表性示意圖。接種液制備是在帶有灌流袋的波浪式生物反應(yīng)器中進(jìn)行的，該灌流袋直接用 HCD冷凍管接種。攪拌式一次性生產(chǎn)生物反應(yīng)器與 ATF 系統(tǒng)一起連續(xù)運(yùn)行。雖然可以將多種培養(yǎng)基補(bǔ)液添加到生產(chǎn)生物反應(yīng)器中，但通過(guò)控制收獲流和廢棄流來(lái)保持體積恒定。它們的比例取決于生產(chǎn)細(xì)胞系的生長(zhǎng)速度。在這種情況下，使用優(yōu)化的灌流培養(yǎng)基是提高工藝穩(wěn)定性和降低工藝成本的重要一步。
現(xiàn)代 mAb 生產(chǎn)工藝的典型連續(xù)USP 流程圖。
高 VCD（> 1 x108 cells/mL）的長(zhǎng)期運(yùn)行導(dǎo)致了對(duì)生產(chǎn)生物反應(yīng)器及其內(nèi)部和外部支持設(shè)備的高要求。Thermo Fisher Scientific HyPerforma DynaDrive 系列的 50 L 生物反應(yīng)器是專門設(shè)計(jì)用于非常高細(xì)胞密度的連續(xù)和強(qiáng)化補(bǔ)料分批操作的下一代攪拌式一次性生物反應(yīng)器的一個(gè)例子。Hyperforma DynaDrive 系列包括 50 L、500 L 和 5 m3 版本的生物反應(yīng)器，帶有立方體形袋和特殊的調(diào)節(jié)比，即 10:1（50 L）和 20:1（500 L，5 m3），而不是通常的 5:1。這意味著該系列生物反應(yīng)器已經(jīng)可以在其最大工作體積的 10% 甚至 5% 下運(yùn)行。它們配備了一個(gè)低剪切鉆孔鼓泡（能夠產(chǎn)生足夠的氧氣傳輸和二氧化碳脫氣）和一個(gè)帶有多個(gè)雙葉葉輪的靈活傳動(dòng)系統(tǒng)，能夠在中等轉(zhuǎn)速和葉尖速度下實(shí)現(xiàn) < 60 秒的混合時(shí)間。
ABEC、Cytiva、Merck Millipore、PALL 和 Sartorius 提供其它適用于生產(chǎn)規(guī)模灌流的一次性生物反應(yīng)器。從生物反應(yīng)器中收獲的產(chǎn)品液流，例如與 ATF 系統(tǒng)一起使用時(shí)，被傳輸?shù)?DSP，在那里純化 mAb。
連續(xù)一次性DSP
使用連續(xù)操作的一次性設(shè)備可以節(jié)省緩沖液、填料和耗材。更具體地說(shuō)，研究結(jié)果表明，與經(jīng)典的不銹鋼批次工藝相比，使用一次性連續(xù) DSP 可以節(jié)省 36-55% 的成本。
雖然捕獲步驟通常仍使用Protein A柱在結(jié)合-洗脫模式下進(jìn)行，但有策略將幾根柱子并聯(lián)并循環(huán)運(yùn)行，這意味著可以使用小得多的柱子。這種方法被稱為多柱層析或逆流層析，并且在設(shè)計(jì)上有所不同。在這里，生產(chǎn)生物反應(yīng)器后的保持步驟被消除，緩沖液和填料的消耗減少。Sartorius 的 BIOSMB 平臺(tái)和 ARTeSYN Biosolutions（Repligen子公司） 的系統(tǒng)是連續(xù)一次性使用的多柱層析系統(tǒng)的例子，它們可用于捕獲步驟中的結(jié)合-洗脫層析法和隨后的流穿純化步驟。它們是符合 GMP 的多柱層析系統(tǒng)，具有完全一次性的產(chǎn)品流路。Merck和Bayer都在連續(xù) mAb 生產(chǎn)過(guò)程中使用BioSMB 系統(tǒng)進(jìn)行捕獲步驟和陽(yáng)離子交換或混合模式層析。
到目前為止，精純步驟大多在結(jié)合-洗脫模式下進(jìn)行。通常，使用離子交換層析法、疏水相互作用層析法或混合模式層析法進(jìn)行純化，以進(jìn)一步純化目標(biāo)產(chǎn)物。在這種情況下，改為連續(xù)使用可能會(huì)產(chǎn)生與捕獲層析法相同的積極效果。通過(guò)結(jié)合污染物而不是目標(biāo)產(chǎn)品使連續(xù)操作變得可行。然后目標(biāo)產(chǎn)物流過(guò)柱子。一旦層析柱充滿污染物，就會(huì)發(fā)生污染物穿透，必須更換層析柱。雖然沒(méi)有實(shí)現(xiàn)真正的連續(xù)模式，但這種流穿模式被認(rèn)為是偽連續(xù)的。Gupta等人使用耐鹽的一次性陰離子交換膜在流穿模式下實(shí)現(xiàn)了超過(guò) 90% 的 HCP 去除率，而使用傳統(tǒng)填料時(shí)的去除率低于 70%。
一份報(bào)告描述了一種多柱層析法，其中捕獲步驟和兩個(gè)精純步驟串聯(lián)連接。三個(gè)平行流路交替上樣，使用一次性膜吸附。在Sanofi，這種在 500 L 工藝中實(shí)施的操作模式使層析柱尺寸減少了 66%，抗體純化工藝的生產(chǎn)率提高了 10 倍。
目前，通常的做法是在捕獲步驟之后執(zhí)行病毒滅活步驟，并且通常在最終超濾/洗濾之前執(zhí)行除病毒過(guò)濾步驟。病毒滅活通常通過(guò)將 pH 值轉(zhuǎn)移到酸性范圍來(lái)進(jìn)行。對(duì)于傳統(tǒng)（批次）DSP 環(huán)境中的病毒滅活步驟，使用了混合罐，添加酸，然后用堿中和，這里，存在兩種實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作的方法：作為第一種選擇，經(jīng)典方法可以采用兩個(gè)交替操作的一次性混合器。例如，Pall的 Cadence 病毒滅活系統(tǒng)就使用了這種方法。第二種可能性是使用活塞流反應(yīng)器，在反應(yīng)器入口處將酸添加到產(chǎn)品流中。產(chǎn)品在活塞流反應(yīng)器中的停留時(shí)間內(nèi)保持低 pH 值，之后在出口處通過(guò)添加堿進(jìn)行中和。為了收斂到最佳活塞流條件，應(yīng)避免返混，并將產(chǎn)品停留時(shí)間的差異保持在最低限度。除了通過(guò)低 pH 值滅活外，還可以在活塞流反應(yīng)器中使用 UV-C 輻射滅活病毒。然而，輻射會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)損傷。目前市場(chǎng)上沒(méi)有用于紫外線病毒滅活的商用一次性設(shè)備。
降低病毒的第二步，即除病毒過(guò)濾，在精純步驟之后。這通常涉及死端納濾。這些過(guò)濾器可成功地用于連續(xù) DSP，即在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)和低流量條件下，已經(jīng)在各種研究中進(jìn)行了描述。在連續(xù)運(yùn)行中，兩個(gè)單獨(dú)的過(guò)濾器并聯(lián)連接。一旦一個(gè)過(guò)濾器達(dá)到其處理量限制，例如由于壓力限制，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)切換到另一個(gè)過(guò)濾器。然后在接封管機(jī)的幫助下更換第一個(gè)過(guò)濾器。
最近，針對(duì)批次和連續(xù)培養(yǎng)，有小組研究了用于除病毒過(guò)濾的4種不同過(guò)濾器與 mAb 生產(chǎn)工藝相關(guān)的性能。在以 0.3 L/m2/h 的流速連續(xù)過(guò)濾 72 小時(shí)期間，應(yīng)用啟停方案來(lái)確定哪些過(guò)濾器適合在低壓環(huán)境中連續(xù)運(yùn)行。兩個(gè)測(cè)試的第二代過(guò)濾器，即 Pall Pegasus Prime 和 Sartorius Virosart HF，能夠在整個(gè)過(guò)濾時(shí)間內(nèi)，在至少 20 L/m-2 的條件下，使log降低值保持在 4 以上。額外的短期和長(zhǎng)期停止試驗(yàn)以研究壓力波動(dòng)的影響，在一段時(shí)間后顯示出穩(wěn)定狀態(tài)，使連續(xù)運(yùn)行成為可能。然而，對(duì)于基于一次性使用的連續(xù)操作模式而言，高達(dá) 1 bar 的壓力降低可能允許噬菌體在操作開始時(shí)通過(guò)更大的過(guò)濾孔流動(dòng)。
通常，mAb 制劑需要幾個(gè) TFF 步驟，為此可以使用一次性設(shè)備。然后通過(guò)超濾濃縮產(chǎn)物，通過(guò)洗濾轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)木彌_系統(tǒng)中，并通過(guò)第二個(gè)超濾步驟達(dá)到最終濃度。這里，SPTFF可用于連續(xù)應(yīng)用。過(guò)濾時(shí)間可以通過(guò)更高的膜面積和更低的流速增加到所需的程度，以至于一個(gè)連續(xù)的過(guò)濾步驟就足夠了。該方法可用于蛋白質(zhì)濃縮和洗濾。對(duì)于這兩個(gè)步驟，一次性設(shè)備版本已經(jīng)可用。SPTFF 洗濾過(guò)程中的緩沖液消耗量相對(duì)較高，但可以通過(guò)使用多個(gè) SPTFF 組件以及在逆流洗濾方法中從晚期到早期步驟進(jìn)行緩沖液回收來(lái)減少。
整體成本比較
在比較批次工藝和連續(xù)工藝時(shí)，根據(jù)工藝模式考慮成本與技術(shù)可行性同樣重要。雖然有幾份報(bào)告比較了批次和連續(xù)工藝模式之間的成本，但其中大多數(shù)沒(méi)有考慮完全基于一次性使用的生產(chǎn)，而是考慮混合工藝。然而，常識(shí)是，基于一次性使用的生產(chǎn)有利于較小的生產(chǎn)規(guī)模，其中一次性設(shè)備的有限尺寸，特別是生物反應(yīng)器的工作體積，并不構(gòu)成挑戰(zhàn)。此外，通常可以通過(guò)使用連續(xù)生產(chǎn)工藝來(lái)實(shí)現(xiàn)更小的工廠規(guī)模。最近的一項(xiàng)研究報(bào)告稱，補(bǔ)料分批工藝導(dǎo)致 mAb 生產(chǎn)的商品運(yùn)營(yíng)成本 (COG) 為 $99/g，而連續(xù)工藝的商品運(yùn)營(yíng)成本 (COG) 為 $51/g。這種成本差異也部分是由于占地面積更小以及儲(chǔ)罐更少，這導(dǎo)致設(shè)施成本降低了66%。分解為單個(gè)單元操作，下游部分的填料成本降低導(dǎo)致連續(xù)工藝中的耗材成本降低了 68%。基于一次性使用的連續(xù)上游工藝也已被證明是具有成本效益的選擇，但是，如果使用一次性設(shè)備執(zhí)行上游和下游操作，則會(huì)看到更大的好處，如多個(gè) COG 模擬研究所示。
在并行化和靈活性方面也看到了成本效益，這可以通過(guò)一次性設(shè)備的應(yīng)用得到支持。消除清潔和在線滅菌程序降低了設(shè)備的復(fù)雜性，這本身就降低了資本成本并減少了停機(jī)時(shí)間。據(jù)計(jì)算，從 1,300 kg 的年生產(chǎn)規(guī)模和 3 g/L 的上游滴度來(lái)看，使用 2,000 L 生物反應(yīng)器的完全一次性 mAb 生產(chǎn)成為優(yōu)于相同或更高上游工作體積的不銹鋼選項(xiàng)的優(yōu)選選擇。在較高的上游滴度下，一次性使用的變化總是有利的。如果分解為單元操作，當(dāng)應(yīng)用連續(xù)工藝而不是批次工藝時(shí)，尤其是在可能的情況下與基于一次性使用的方法結(jié)合使用時(shí)，多個(gè)步驟的成本節(jié)省可能很大。更具體地說(shuō)，根據(jù)抗體生產(chǎn)工藝中Protein A捕獲步驟的滴度和規(guī)模，可實(shí)現(xiàn)超過(guò) 20% 的節(jié)省。Pollard等人使用凈現(xiàn)值 (NPC) 估算三種 mAb 生產(chǎn)方案的成本，這構(gòu)成了產(chǎn)品的凈現(xiàn)值，沒(méi)有銷售利潤(rùn)。在一種情況下，將傳統(tǒng)不銹鋼設(shè)備與一次性設(shè)備進(jìn)行比較，分別用于滴度高于 10 g/L 的強(qiáng)化工藝和完全連續(xù)的工藝。初始工藝使用 6 × 15,000 L 生物反應(yīng)器，滴度為 3 g/L，一次性生物反應(yīng)器工藝使用 6 × 2,000 L 生物反應(yīng)器。連續(xù)灌流工藝的生產(chǎn)率設(shè)定為 2 g/L/day。在 1 噸的年產(chǎn)量下，強(qiáng)化一次性和連續(xù)生產(chǎn)工藝的 NPC 降低了約 60%。
進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)簡(jiǎn)化操作和提高工藝穩(wěn)健性以及成本效率，還應(yīng)關(guān)注用于監(jiān)控和控制策略的過(guò)程分析技術(shù)，特別是對(duì)于一次性設(shè)備，因?yàn)樵诨谝淮涡允褂玫墓に囍羞€不能完全達(dá)到類似程度的傳感器應(yīng)用。
總結(jié)
分析顯示，全球治療性單克隆抗體市場(chǎng)在不久的將來(lái)會(huì)繼續(xù)增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)到 2025 年收入將達(dá)到 3,000 億美元。在這個(gè)框架中，使用一次性系統(tǒng)強(qiáng)化和連續(xù)的 USP 和 DSP 單元操作非常適合減少 mAb 開發(fā)和生產(chǎn)的時(shí)間和成本。關(guān)于連續(xù)工藝，正在積極追求 30 至 120 天的運(yùn)行時(shí)間。連續(xù) USP 已經(jīng)用于一些獲批的 mAb，而第一個(gè)完全連續(xù)生產(chǎn)的 mAb 目前已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中。然而，仍有挑戰(zhàn)需要克服。對(duì)于 USP，這歸因于生物反應(yīng)器袋（及其組件，如葉輪、密封件、鼓泡等）和用于灌流裝置的塑料的堅(jiān)固性以及機(jī)械穩(wěn)定性。由于長(zhǎng)期使用，對(duì)袋子的設(shè)計(jì)要求很高，特別是攪拌罐反應(yīng)器的葉輪、鼓泡、廢氣過(guò)濾器的設(shè)計(jì)和泡沫控制。為此，適于連續(xù)使用級(jí)別一次性塑料是必不可少的。需要保證氧氣傳遞系數(shù) > 15 h-1 和足夠的 CO2 脫氣，以及在中等攪拌器葉尖速度下的足夠的單位功率輸入。此外，還需要：(1) 改進(jìn)的管路和連接器，(2) 改進(jìn)的、新的一次性傳感器和探針，(3) 安裝冗余傳感器和過(guò)濾器以及相應(yīng)的更換策略，以及 (4) 一次性使用泵可在低流量（0.1 L/min – 2 L/min）下運(yùn)行且保持高精度。這四點(diǎn)同樣適用于 DSP。
如前所述，另一個(gè)涉及連續(xù) USP 和 DSP 單元操作的挑戰(zhàn)是連續(xù)工藝溶液暴露于 L&E 的影響，工藝時(shí)間可能長(zhǎng)達(dá) 4 個(gè)月。因此，必須確認(rèn)所有 USP 和 DSP 單元操作的L&E 特征和相應(yīng)的緩解策略（例如水或緩沖液沖洗、可析出物清除、一次性設(shè)備更換）。如果成功，目前使用一次性系統(tǒng)生產(chǎn) mAb 的經(jīng)典和強(qiáng)化補(bǔ)料分批工藝將越來(lái)越多地被連續(xù)操作方法所取代。
原文：J.Muller, M.Teale, S.Steiner, et al., Intensified and Continuous mAb Production with Single-Use Systems. Cell Culture Engineering and Technology, 2021.
