開發(fā)可負(fù)擔(dān)且可獲得的COVID-19疫苗的熱潮不僅加速了基于病毒載體、mRNA和pDNA的疫苗等治療模式的研發(fā)，而且還向生物工藝界提出了挑戰(zhàn)，要求其解決這些重要救命藥物生產(chǎn)過程中與規(guī)模放大相關(guān)的獨(dú)特挑戰(zhàn)。本文闡述了目前的一些想法和經(jīng)驗(yàn)，以消除瓶頸的潛在挑戰(zhàn)，從而將腺病毒載體技術(shù)放大至2000 L及以上。
腺病毒載體是將基因遞送至特定人類細(xì)胞的有吸引力的載體，已被廣泛用于COVID - 19疫苗和基因治療。這些載體可以容納大的轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止和分裂的細(xì)胞，并且不整合到宿主的基因組中。越來越多的臨床試驗(yàn)基于將腺病毒用作轉(zhuǎn)基因遞送載體(用于基因治療)、疫苗載體以及用作載體(用于溶瘤病毒療法)。
腺病毒載體技術(shù)已經(jīng)存在很長(zhǎng)一段時(shí)間了，越來越關(guān)注病毒載體生產(chǎn)和開發(fā)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素包括降低產(chǎn)品成本(包括大規(guī)模生產(chǎn)以及降低原材料成本)的需要以及提高最終產(chǎn)品的純度水平。
圖1. 在2000L規(guī)模條件下，生產(chǎn)腺病毒載體的生產(chǎn)流程示意圖。
使用HEK 293宿主的生產(chǎn)過程的總體示意圖如圖1所示，它包括了上游工藝過程中細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒感染階段的逐級(jí)放大，以及下游工藝過程中一系列的過濾、濃縮和層析步驟，以生產(chǎn)高純度的原料藥。
盡管該工藝單元的操作看起來并不復(fù)雜，但由于細(xì)胞生長(zhǎng)不穩(wěn)定、病毒滴度低、產(chǎn)物聚集、目的產(chǎn)物分離效率低，以及處理大體積病毒感染相關(guān)的操作復(fù)雜性，大規(guī)模生產(chǎn)仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。表1詳細(xì)說明了工藝規(guī)模放大期間預(yù)計(jì)面臨的挑戰(zhàn)和可能采取的緩解策略。
表1. 病毒載體規(guī)模放大過程中預(yù)期的挑戰(zhàn)以及潛在的緩解策略。
上游挑戰(zhàn)和緩解策略
在大規(guī)模生物反應(yīng)器中以HEK293為基礎(chǔ)的病毒載體血清型生產(chǎn)的整體策略圍繞三個(gè)因素:在放大階段最優(yōu)的HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)，在生產(chǎn)過程中獲得最優(yōu)的感染復(fù)數(shù) (MOI) 的優(yōu)質(zhì)病毒種子以及最優(yōu)的工藝參數(shù)、以獲得最高的病毒滴度。
盡管HEK293細(xì)胞已被廣泛應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域，但選擇最佳培養(yǎng)基、補(bǔ)液添加物和工藝參數(shù)以避免細(xì)胞聚集、細(xì)胞生長(zhǎng)滯后和活性下降是至關(guān)重要的。在生物反應(yīng)器中，典型的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)，如pH、溫度和溶氧水平，通?？梢缘玫胶芎玫目刂?，但與其它常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型相比，HEK293細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)溶氧水平、滲透壓、培養(yǎng)基補(bǔ)液策略和代謝物水平表現(xiàn)出更高的敏感性。因此，開發(fā)控制這些重要參數(shù)的控制策略對(duì)于實(shí)現(xiàn)一致的細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物滴度是非常關(guān)鍵的。
在生產(chǎn)過程中，用于感染HEK293細(xì)胞的病毒種子的質(zhì)量是另一個(gè)重要參數(shù)，因?yàn)樗x了在生產(chǎn)過程中可感染單個(gè)HEK293細(xì)胞的病毒數(shù)量，因此，在病毒滴度方面影響批次產(chǎn)出。要避免的最重要的因素之一是細(xì)胞聚集，這可能導(dǎo)致非最佳的生長(zhǎng)以及感染效率的損失，從而導(dǎo)致收獲結(jié)束時(shí)生產(chǎn)力的降低。雖然在某些情況下，添加抗聚集試劑可能有助于解決聚集問題，但在大多數(shù)情況下，未達(dá)到最佳狀態(tài)的攪拌是根本原因。因此，攪拌速率需要通過設(shè)計(jì)良好的策略 (P/V、Kla、剪切應(yīng)力、葉尖速度等) 來優(yōu)化，以避免任何傳質(zhì)和混合限制，但同時(shí)保持低剪切應(yīng)力。此外，我們需要開發(fā)病毒滴度定量分析(顯著縮短TAT)來可靠地估算MOI，從而用于計(jì)算用于感染的病毒種子體積。
最后，感染階段的參數(shù)，包括溫度、最適細(xì)胞周期階段、感染時(shí)的細(xì)胞密度、感染持續(xù)時(shí)間和培養(yǎng)的pH值，對(duì)收獲期末的病毒滴度產(chǎn)量有顯著影響。這些參數(shù)需要使用多變量設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法仔細(xì)優(yōu)化，以獲得最大的病毒滴度產(chǎn)量。
下游挑戰(zhàn)和緩解策略
大規(guī)模下游生產(chǎn)的主要挑戰(zhàn)是回收產(chǎn)品質(zhì)量和純化過程結(jié)束時(shí)的穩(wěn)定性不一致。在各種單元操作過程中，pH值、熱應(yīng)力或機(jī)械應(yīng)力均可引起病毒顆粒聚集。這些聚集的顆粒非特異性且“強(qiáng)烈”地結(jié)合到填料上，導(dǎo)致重大的產(chǎn)物損失。為了盡量減少聚集造成的損失，整個(gè)中游和下游都需要精心設(shè)計(jì)。細(xì)胞裂解、核酸內(nèi)切酶處理和TFF等單元操作需要優(yōu)化，以避免剪切力，這可能也有助于降低病毒顆粒的聚集。
層析法被認(rèn)為是純化的主要模式，但當(dāng)與切向流過濾相結(jié)合時(shí)，其效率可以提高好幾倍。在大規(guī)模生產(chǎn)中，TFF是一種強(qiáng)大的分離工具，它顯著減少了后續(xù)層析步驟的產(chǎn)品處理體積以及雜質(zhì)負(fù)荷( 小蛋白、培養(yǎng)基成分和其它不需要的雜質(zhì))，從而使層析專注于特定雜質(zhì)的分離 (如圖2所示)。
腺病毒對(duì)剪切敏感，在濃縮和換液過程中衣殼的任何構(gòu)象變化都可能導(dǎo)致高聚集和低回收率，因此優(yōu)化這一步驟、以使剪切條件最小化是必要的。雖然氯化鎂、聚山梨醇酯80和氯化鈉等緩沖液中的一些穩(wěn)定劑可以幫助穩(wěn)定病毒顆粒，但其它策略與最小化工藝保持時(shí)間以及在較低溫度下保持工藝中間產(chǎn)物有關(guān)。
圖2. 使用切向流過濾進(jìn)行病毒收獲裂解液的濃縮和換液，切向流過濾是病毒載體純化中的關(guān)鍵步驟。
對(duì)于病毒載體，另一個(gè)可能隨著規(guī)模放大而加劇的問題是在純化過程結(jié)束時(shí)將不需要的空衣殼與包裝的完整衣殼(所需產(chǎn)物)進(jìn)行穩(wěn)健的分離，以達(dá)到所需的空衣殼和完整衣殼的比例。
密度梯度離心機(jī)可以有效地將空衣殼與完整衣殼分離，但該技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)，且存在可放大性限制。最廣泛使用的層析步驟是陰離子交換，操作接近中性環(huán)境，允許在梯度洗脫條件下選擇性分離空衣殼。其它層析，如陽離子交換，和膜層析也可以用于獲得高度純化的完整衣殼。
批次間最終產(chǎn)物的不一致性主要是由于下游層析操作中空衣殼和完整衣殼分離不良所致。對(duì)離子交換層析單元操作的充分優(yōu)化有助于完整衣殼的富集，以獲得較高的回收率以及最終產(chǎn)品中這兩種物質(zhì)的一致比例。
病毒載體生產(chǎn)的分析工具
開發(fā)大規(guī)模、優(yōu)化的病毒載體生產(chǎn)、收獲和純化工藝要求具有準(zhǔn)確和可重復(fù)的分析工具，以監(jiān)測(cè)質(zhì)量屬性，確保安全、一致、高質(zhì)量和有效的產(chǎn)品。表2列出了通常用于過程中產(chǎn)物表征和控制的具體分析方法，以確保過程和產(chǎn)物的穩(wěn)健性。這些分析技術(shù)不僅有助于工藝優(yōu)化 (提高病毒滴度和步驟回收率)，而且是工藝規(guī)模放大總體成功的關(guān)鍵指標(biāo)。
表2. 病毒載體生產(chǎn)中，增強(qiáng)過程理解、緩解規(guī)模放大相關(guān)挑戰(zhàn)的分析工具。
設(shè)施設(shè)計(jì)和適當(dāng)?shù)那鍧嵖刂?/span>
由于病毒載體產(chǎn)品的特性，為其精心設(shè)計(jì)工廠設(shè)施是實(shí)現(xiàn)可預(yù)測(cè)和穩(wěn)健運(yùn)營結(jié)果的關(guān)鍵。腺病毒載體生產(chǎn)的主要挑戰(zhàn)之一是過早感染HEK293細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)，這可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良和批次提前終止，導(dǎo)致產(chǎn)品產(chǎn)量不理想。因此，根據(jù)設(shè)計(jì)，設(shè)施中的不同潔凈室需要在人員物料移動(dòng)、空氣處理單元的隔離以及病毒區(qū)和非病毒區(qū)之間的其它程序控制方面進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂?。此外，還需要建立有效的清潔、衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測(cè)程序，并輔以產(chǎn)品特異性分析檢測(cè)，以控制和規(guī)避任何病毒污染的殘余風(fēng)險(xiǎn)。
總結(jié)
隨著細(xì)胞和基因治療領(lǐng)域的重點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)品的商業(yè)化，以解決疾病領(lǐng)域日益增長(zhǎng)的需求，生產(chǎn)商開發(fā)大規(guī)模、穩(wěn)健的工藝勢(shì)在必行，這些工藝既要滿足嚴(yán)格的監(jiān)管要求，又要旨在推動(dòng)全球范圍內(nèi)的可負(fù)擔(dān)性和可及性。然而，具體的技術(shù)和操作挑戰(zhàn)需要通過精心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方法和經(jīng)驗(yàn)知識(shí)來緩解，以確保成功的工藝放大。
