廢棄液（Bleed）循環是一種通過濃縮工藝廢棄液、以選擇性去除生物質并循環液體部分，來提高穩態灌流工藝產量的新方法。這導致顯著的產品節省，后者否則將被浪費。只要能對細胞進行濃縮分離，現有的細胞分離裝置都可以用于此類應用。然而，比較廢棄液循環應用的操作模式和效率的信息有限。傾斜重力沉降首次被用作廢棄液循環技術，并與聲學分離進行了比較。除了較低的碎片去除率外，傾斜重力沉降顯示出相似的廢棄液循環效率，并且對細胞活性、營養和代謝物水平以及產品質量沒有負面影響。此外，考慮到降低系統復雜性以及便于規模放大，傾斜重力沉降是在 42 天實驗室規模灌流工藝中進一步評估的首選技術。實現了高達 3.5 倍的廢棄減低以及 19% 的平均收獲率提升。隨后使用適用于 2,000 L 灌流工藝的大型傾斜重力沉降器測試了可放大性，以確認實驗室規模實驗的性能。來自篩選實驗的廢棄液循環特征數據與可放大性論證相結合，有助于在考慮新灌流工藝設置的廢棄液循環以減少灌流浪費、提高工藝可持續性和提高整體工藝產量時做出決策。
廢棄液循環是一項通過減少廢物流（工藝廢棄液）來最大化穩態灌流產量的新技術。因此，將聲學分離與傾斜重力沉降進行比較，以評估它們在各種工藝條件下進行連續廢棄液循環操作的適用性。兩種技術均未觀察到對工藝代謝物和產品質量的影響，同時顯著提高了工藝產量。隨后擴大 2,000 L 灌流工藝，證實了實驗室規模的實驗結果。
最近關于灌流細胞培養的報道顯示其單位體積生產率增加、產品質量更均勻，以及由于不穩定蛋白質在生物反應器中的產品停留時間減少而帶來的好處。單克隆抗體的連續生產包括穩態灌流細胞培養過程，隨后是連續捕獲步驟和多個精純步驟。為了實現穩態灌流操作，不僅需要用于無細胞收獲的細胞截留裝置 (CRD)，還需要用于去除過多生物質的廢物流（廢棄液，Bleeding）。廢棄不是選擇性操作，因為廢棄與生物反應器中的培養物具有相同的成分。假設工藝活細胞體積 (VCV) 為10%，意味著 10% 生物質和 90% 液體部分的廢棄組合物。由于在穩定的灌流工藝中需要通過廢棄操作來維持目標細胞密度，這會導致大量液體（含有目的產品）與過多的生物質一起被浪費。
在計算灌流工藝的產量時，必須考慮產物濃度（收獲滴度）和收獲率。因此，過高的廢棄率在工藝強化方面是不受歡迎的，因為它們會導致收獲率降低。盡管行業內收獲滴度有了重大改進，但很少有人關注灌流廢棄液率的降低。
提高工藝產量的第一個策略包括降低整體工藝廢棄率。文獻報道了細胞周期抑制劑或溫度變化對生長的抑制。盡管提高了工藝產量，但生長抑制會導致產品質量發生變化。此外，廢棄率對應于細胞分裂率。雖然低細胞分裂率最初可能會提高工藝產量，但這種方法可能會危及細胞培養的長期高活性和穩定性。
第二種策略是濃縮廢棄液流、以減少伴隨廢棄液流中的生物質而被浪費的液體部分。只有濃縮的生物質被直接處理成廢物，澄清的液體被引導回生物反應器，從而提高灌流收獲率和工藝產量。來自生物反應器的廢棄流對應于細胞分裂率，在這種情況下沒有減少，但其中很大一部分液體被循環回生物反應器。因此，最近進行了一項概念驗證研究，該研究使用聲學分離器實施固液分離步驟，以濃縮灌流工藝廢棄流中的生物質，并將其指定為廢棄循環。在 5% 的 VCV 下，在 2 L 規模下測試了 4 天的時間，檢測到良好的分離效率，并且產品質量或代謝物概況沒有變化。液體-固體分離裝置，而不是生長抑制，可以通過在不降低培養性能的情況下保持足夠高的廢棄率，從而降低長期工藝穩定性的風險。Bielser 等人的研究是文獻中關于廢棄液循環的第一份報告，需要進一步研究，以探索其在較高 VCV 和不同灌流工藝條件下的潛在益處。此外，尚未證明用于廢棄液循環的聲學分離的可放大性。
聲學分離器使用聲學共振場，使個體細胞聚集在一起，并形成更大的細胞聚集體。這些細胞聚集體由于尺寸較大而顯示出增強的沉降特性，并且一旦聲波中斷，就會更快地沉降。雖然在小規模操作中使用聲學沉降器作為 CRD 可以獲得非常有前途的分離結果，但關于聲學分離器的大規模應用的信息有限。聲學分離器已成功測試用于澄清體積高達 200 L/day，并建議通過合并多個較小的聲學室進一步擴大規模。開發更大規模的聲學分離器似乎非常困難，因為細胞分離需要大量的功率輸入，導致設備內產生熱量。多室系統可能會解決散熱問題，但會大大增加系統的復雜性，因此需要探索更多技術作為廢棄液循環的替代方案。這些技術應該不那么復雜，更容易放大，但表現出相似的性能特征。
除了聲學分離，傾斜重力沉降已成功用作 CRD 以維持穩定的灌流過程。與聲學分離器相比，傾斜重力沉降器被廣泛研究并用于大規模生產生物反應器，因為它們的復雜性相對較低，且具有良好的可放大性，使它們成為用于廢棄液循環的聲學分離的有趣替代方案。當顆粒（在本例中為細胞）在傾斜通道內沉降時，在通道底部形成更高密度的漿液。在重力的驅動下，漿液從表面滑落，產生增強沉降過程的對流，被稱為“Boycott 效應”。由于沒有聲學共振場的聚集支持，傾斜重力沉降器往往比聲學分離器大。這伴隨著傾斜重力沉降器內培養物停留時間的增加，在用于廢棄液循環時，對培養性能的影響未知。
由于沉降技術不能保證 100% 澄清的培養收獲，這導致廣泛使用基于過濾器的細胞截留裝置，主要使用基于中空纖維組件的切向流過濾 (TFF) 和交替式切向流 (ATF) 技術，廢棄液循環的工藝要求不同。在廢棄液循環的情況下，循環裝置的主要目的是盡可能多地濃縮細胞而不是提供完整的無細胞收獲流。澄清的循環液流，即使含有一些剩余的細胞，也將被引導回生物反應器并最終增加收獲流。用于進一步下游工藝操作的過濾由主細胞截留裝置執行，而不是由廢棄液循環裝置執行。由于不僅整個細胞而且更小的顆粒（如細胞碎片）都可以循環到生物反應器中，因此應研究細胞碎片對細胞截留過濾器污染的可能負面影響。定義關鍵工藝碎片水平和與過濾器污染的相應相關性尚未得到證實，并且很可能會根據所選的工藝參數、設備和操作模式而變化。
本研究的目的是證實廢棄液循環在工業相關灌流工藝強化中的應用。傾斜重力沉降首次用作廢棄液循環裝置，并在廢棄液循環效率、代謝物概況、產品質量屬性、細胞碎片去除和操作簡便性方面與聲學分離進行了比較。在實驗室規模研究了涵蓋工藝 VCV、工藝廢棄率和沉降器操作參數的各種灌流方案，以量化通過廢棄液循環對各種情況進行工藝強化的潛力。通過建造一個大型傾斜重力沉降器和循環 2000 L 灌流生物反應器廢棄流，證明了廢棄循環的可放大性。報告了成功結果的詳細信息，重點關注了廢棄液循環技術的性能，更重要的是，還關注了廢棄液循環對細胞培養性能和產品質量的影響。
詳細試驗操作和結果，請參考原文。
中試規模灌流細胞培養
一種生產雙特異性單克隆抗體 (mAb2) 的專有 CHO-K1 細胞系在 200 L 灌流生物反應器（Mobius 200 L 生物反應器，Merck KGaA）中培養。VCV 使用在線電容探針（Incyte Arc，Hamilton）保持恒定在 8%。使用孔徑為 0.22 μm 的聚醚砜中空纖維（Repligen）截留細胞。生產完成后，剩余的細胞培養液用于測試大型傾斜重力沉降器（Constructions Inoxydables SA），其流量適應 2000 L 灌流生物反應器。在實驗過程中，細胞培養液攪拌并保持在 35°C。使用 CO2 或 1.1 M Na2CO3 將 pH 控制在 6.95 ± 0.15（InPro3253i，Mettler Toledo），并將 DO 保持在 50%（InPro6860i/12/120/nA，Mettler Toledo）。停止灌流和電容控制。
大規模灌流細胞培養
將 2000 L 生物反應器（Mobius 2000 L 生物反應器，Merck KGaA）以活細胞密度 0.67 × 10^6 cells/mL（mAb1）進行接種，恒定填充體積為 1,500 L。使用 CO2 或 1.1 M Na2CO3 將pH 控制在 6.95 ± 0.15（InPro3253i，Mettler Toledo)，DO 維持在 50% (InPro6860i/12/120/nA, Mettler Toledo)。在生長階段，溫度保持在 36.5 °C，一旦達到電容設定點，溫度調整至 33 °C。VCV 使用在線電容探針（Incyte Arc）保持恒定在 8%。流量計（LFS-03SU-Z-SC1-G25，Levitronix）用于工藝廢棄管線，以監測流量并從總體目標收獲率中扣除該量。灌流率在生長期逐漸增加，直到 1.3 RV/day，自此保持恒定到運行結束。通過兩個并聯的一次性交替式切向流裝置（XCell ATF? 10，Repligen）和孔徑為 0.22 μm 的聚醚砜中空纖維截留細胞。在每個 ATF10 上通過流量計控制收獲流速，并通過重量計算，控制新鮮培養基的添加，以保持生物反應器恒定。
大規模傾斜重力沉降器運行
為了進行性能評估，將傾斜重力沉降器（圖 1D）連接到 200L 生物反應器。帶有流量計的泵（LFS-03SU-Z-SC1-G25，Levitronix）用于控制重力沉降器的入口流速。校準泵（Serie 520 U, Watson-Marlow）被放置在重力沉降器的底部出口，以確保濃縮的細胞不會返回沉降器。頂部的出口流量由第二個流量計監測。通過將 200L 培養體積加載到傾斜重力沉降器，以與 2000L 生物反應器填充體積、1.3 VVD 灌注率和 18%（470L/day）、23% (600L/day) 和 28% (730L/day) 的廢棄率相匹配的操作速度來評估大型重力沉降器的性能。同時，沉降器回收率達到 75% 的目標。
對于大規模評估，傾斜重力沉降器連接在 2000L 生物反應器的廢棄管線上，在控制狀態下填充體積為 1500L。入口流量（廢棄流）由電容探針調節。澄清的回收（重力沉降器頂部）和濃縮廢物（設備底部）連接到兩個獨立的罐中。由于存在不同于 2L 灌流運行的另一個控制系統，因此必須更改控制策略。不是根據工藝廢棄流來調整流速，而是將沉淀器上濃縮廢物的固定泵速設置為達到大約 70% 的循環率。基于 430L/day的平均過程廢棄量，濃縮廢棄泵設置為 130L/day。為了穩定工藝廢棄流，工藝廢棄流的上限設置為 450L/day。
圖 1. 廢棄液循環設置 (A)、實驗室規模聲學沉降器 (B)、實驗室規模傾斜重力沉降器 (C) 和大型傾斜重力沉降器 (D) 的示意圖。
圖 6. 實驗室規模 2 L 灌流沉降器運行的過程數據與 mAb1 沒有廢棄循環的標準控制運行的比較。VCV 和活性 (A)、葡萄糖和乳酸濃度 (B)、理論循環率設定點 (C)、氨和 pH 曲線 (D)、工藝收獲率 (E)、收獲滴度和碎片趨勢 (F)、累積收獲量(G) 和累積工藝產量 (H)。灰色區域表示執行了廢棄循環的工藝階段，而在白色工藝階段關閉了廢棄循環。
圖 8. 針對各種工藝廢棄率和循環率的離線大規模 2000L 灌流工藝沉降器評估，顯示入口和循環流的 VCV (A)、分離效率 (B)、細胞活性 (C) 和工藝產量增加 (D)。連接到 2000L 灌流運行的傾斜重力沉降器流速的在線實時數據 (E)。
總結和展望
本研究首次將傾斜重力沉降用于穩態灌流過程中的廢棄液循環應用，并將其與之前使用的聲學分離技術進行了比較。在實驗室規模的實驗中，聲學分離和傾斜重力沉降顯示出相似的廢棄液循環效率，并且對營養物質、代謝物以及產品質量沒有影響。僅用于去除細胞碎片，聲學沉降器在去除較小顆粒方面表現出卓越的性能。
出于簡化規模放大、降低系統復雜性的原因，傾斜重力沉降是長期穩態灌流廢棄液循環所選擇的技術。它在 42 天的灌流細胞培養過程中，在實驗室規模下進行了測試，然后放大到 2000L 灌流工藝。盡管廢棄率存在波動，但開發并測試了自適應自動化策略，以在最佳設定點成功運行沉降裝置。
對于 VCV 設置點為 12% 且廢棄率在 20% 和 25% 之間的實驗室規模的灌流工藝，廢物液流最多可減少 3.5 倍，有效廢棄率降至 6%，從而提高收獲率19%。大型傾斜重力沉降器連接2000L灌流生物反應器，灌流體積為1500 L/day，平均廢棄流430 L/day，循環率為70%，持續保持分離效率高于99%。甚至更高的 600 L/day時，廢棄流也可被成功濃縮，分離效率超過 94%，這代表灌流運行具有 2000 L 灌流體積以及 23% 廢棄率。據作者所知，這是第一次使用傾斜重力沉降器在生產規模上進行廢棄液循環。在兩種規模上都沒有觀察到對產品質量的影響。
在考慮使用該技術提高現有或新灌流工藝的工藝產量時，在廢棄液循環方面獲得的見解為決策提供了合理支持的基礎，這些灌流工藝具有特定的目標工藝 VCV、灌流速率和工藝廢棄速率。同樣，這些知識可以應用于其它用于廢棄液循環的新興技術，例如連續流離心機，只要它們具有合適的尺寸，并允許在灌流細胞培養過程的整個運行期間穩定運行。
